克隆技術(shù)在豬方面的研究

借助體細(xì)胞移植技術(shù)，己成功地獲得了克隆羊、克隆牛和克隆山羊;而在有關(guān)克隆豬的專題報(bào)告中亦采用該方法，即將未分化的早期胚胎細(xì)胞(4細(xì)胞的卵母細(xì)胞胚)作為供核細(xì)胞 與去核卵母細(xì)胞融合。經(jīng)表型選擇后進(jìn)行的豬克隆繁殖，在內(nèi)品生產(chǎn)中具有潛在的重要意義。另外，基因修飾技術(shù)與克隆技術(shù)的結(jié)合能為人類創(chuàng)建外源性移植器官的潛在供體。 

　　從分化細(xì)胞邁向豬克隆的第一個(gè)步驟，就是要對各種可能影響豬體外胚胎發(fā)育的因素進(jìn)行調(diào)查研究。從長白種母豬體采集的成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)2種電激活方法的任何一種刺激后，促使胚胎以單性生殖方式發(fā)育;然后將此胚胎置于微纖絲抑制劑(細(xì)胞分裂抑制素B)中，以避免因細(xì)胞的分裂而造成染色體的丟失，最后將這些胚胎放大3種不同培養(yǎng)基的任何一種內(nèi)進(jìn)行孵化(其它環(huán)境條件保持不變)。在一定強(qiáng)度的電激下，經(jīng)多次脈沖刺激的胚胎其發(fā)育數(shù)少于采用單次脈沖電激的胚胎;另外，培養(yǎng)基的種類也影響了胚胎的發(fā)育，胚胎在 NCSU23培養(yǎng)基中發(fā)育情況最佳。隨后，用單一的1.5kv/cmlOOμs脈沖電流刺激NCSU23培養(yǎng)基中的胚胎，在這些條件下測定體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力(以體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞作對照)。在采用這種電激方式的167個(gè)體外成熟的卵母細(xì)胞中，有116個(gè)在48h內(nèi)分裂，但是僅4 個(gè)發(fā)育至胚泡，該比例顯著地低于相應(yīng)的體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育率(p=0.001，X2=檢驗(yàn))。因此，在以后的試驗(yàn)中采用在體內(nèi)發(fā)育的成熟卵母細(xì)胞。 

　　在眾多有關(guān)家畜克隆的報(bào)道中均以胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，究其原因是這些細(xì)胞能在克隆前進(jìn)行基因修飾。 因此，我們對豬胎兒成纖維細(xì)胞在核移植后繼續(xù)發(fā)育的能力進(jìn)行了評估。將“梅山×梅山( 黑毛)”豬在妊娠24d時(shí)屠殺取其胎兒，經(jīng)胰蛋白酶作用后建立原代細(xì)胞培養(yǎng)。再將細(xì)胞進(jìn)行高密度平板培養(yǎng)傳代2至6次，最后進(jìn)行融合；在不補(bǔ)充培養(yǎng)基的情況下連續(xù)培養(yǎng)l6d，產(chǎn)生的細(xì)胞處在G０期，最后用PCR方法鑒定每個(gè)胚胎的性別。由于與它們的成纖維細(xì)胞抗原性一致，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞對細(xì)胞角蛋白和階段特異性Ⅰ型胚胎抗原呈陰性反應(yīng)，但是對中胚層的標(biāo)記波形蛋白呈強(qiáng)陽性。 

　　由成年體細(xì)胞克隆的小鼠系采用特殊的非融合方法，即通過電壓驅(qū)動微注射方法選擇性地將供體核導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，我們將該方法應(yīng)用于豬的細(xì)胞核移植中。在含有細(xì)胞松弛素的NCSU23培養(yǎng)基中，采用電壓驅(qū)動微注射方法將取自長白小母豬或黑白花小母豬(長白×杜洛克)卵母細(xì)胞中的中期Ⅱ型染色體和第一極體除去，通過電壓驅(qū)動微注射將“梅山×梅山(黑毛)”雜交豬的胎兒成纖維細(xì)胞核單個(gè)導(dǎo)入每個(gè)去核卵母細(xì)胞。重新生成的胚前體在38℃孵化3～4h，然后用脈沖電激活，最后再對所獲得的核移植胚胎進(jìn)行培養(yǎng)。 

　　雖然豬胚胎能在體外很好地發(fā)育至胚泡階段，但移植到代孕母豬的子宮角后，生長發(fā)育情況卻很差。由于要確保母豬能正常妊娠一般至少需要4個(gè)胎兒，據(jù)此推斷如果子宮內(nèi)存在經(jīng)受精產(chǎn)生的輔助胚胎，會有助于克隆胚胎的完全發(fā)育。 

　　為了研究輔助胚胎在子宮內(nèi)促進(jìn)克隆胚胎發(fā)育的能力，設(shè)計(jì)了2個(gè)試驗(yàn)，克隆胚胎在試驗(yàn)Ⅰ中經(jīng)體外培養(yǎng)20h(單細(xì)胞 胚胎)或在試驗(yàn)Ⅱ中經(jīng)體外培養(yǎng)40h(2-4細(xì)胞的胚胎)后，移植到代孕母豬子宮中，所有分娩的后裔仔豬(試驗(yàn)Ⅰ的9只仔豬和系列試驗(yàn)Ⅱ的24只仔豬)全為白色，因此，可以證明這些仔豬為非克隆豬。克隆胚胎無法完成4胎的妊娠全過程的事實(shí)表明，核移植胚胎和輔助胚胎間的比例是相當(dāng)重要的，本次試驗(yàn)中2種胚胎比例顯然不是處在最佳程度。 

　　試驗(yàn)Ⅲ將在2-8細(xì)胞階段間進(jìn)行核移植的11O個(gè)克隆胚胎經(jīng)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基傳代2至6代后，移植到4只 不含輔助授精胚胎的代孕母豬子宮中,其中3只代孕母豬分別在胚胎移植后的27d、35d和6ld 開始發(fā)情，豬的發(fā)情周期為2ld，發(fā)情延遲表明每只代孕母豬已經(jīng)妊娠。由于豬胚胎在子宮壁著床發(fā)生于胚胎發(fā)育的13d至l4d，所以很可能其中2只妊娠母豬在胎盤形成后就終止胚胎發(fā)育，胚胎終止發(fā)育的原因不明。 

　　在第3個(gè)試驗(yàn)中，第4只代孕母豬在接受36個(gè)克隆胚 胎的輸卵管移植后仍繼續(xù)妊娠，而這些克隆胚胎是在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代至第2代時(shí)被取出移植的。其中一個(gè)克隆胚胎發(fā)育到足月，于2000年7月2日自然分娩，所產(chǎn)仔豬取名Xena，初生體重1.2kg，胎盤重0.3kg，兩者均處于非克隆仔豬的正常值范圍內(nèi)。仔豬胎盤經(jīng)解剖觀察表明正常，而有些克隆牛的胎盤畸形，采用核微注射技術(shù)的克隆小鼠，其胎盤始終比非克隆小鼠的大得多。　　 

　　Xena克隆豬體質(zhì)健康、雌性、黑毛色，與“梅山×梅山 ”核供體母體的預(yù)測結(jié)果相符。為了確證這一結(jié)果，從與Xena克隆豬有關(guān)的3個(gè)相關(guān)體 (Xena、長白代孕母豬、培基的成纖維細(xì)胞中提取DNA，設(shè)23個(gè)標(biāo)識組，進(jìn)行特異性微衛(wèi)星標(biāo)記分析。這些分析是在另外的實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行的，因而不帶有任何主觀色彩。分析結(jié)果證實(shí)Xena克隆豬的基因組與梅山豬供核威纖維細(xì)胞的基因組屬同一種類，與長白代字母豬的基因組有明顯的區(qū)別。　 

　　上述研究結(jié)果表明，采用微注射技術(shù)將體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞能成功克隆出豬。雖然還沒搞清全部機(jī)理，但推測部分原因是由于微型吸管 的電壓激活時(shí)操作快速所致;此外，豬克隆的成敗可能與供核細(xì)胞的胞質(zhì)染色體污染敏感度有關(guān)，相對融合(細(xì)胞移植，而言，微注射方法更有利核移植的進(jìn)行。與融合不同，微注射可選擇性地去除大部分供核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，因而相對而言胞質(zhì)的含量在胚胎早期是稀薄的。 

　　為了誘發(fā)牛和羊的種系突變，曾采用了體外細(xì)胞的基因隨機(jī)整合技術(shù)和基因靶技術(shù)，以后則采用與隆有關(guān)的技術(shù)；這些研究結(jié)果為人們展現(xiàn)了這樣一種前景：即這些技術(shù)也可以應(yīng)用于豬。由于豬胚胎干細(xì)胞不能進(jìn)行培養(yǎng)，因此這種技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。也可以借助理想基因型的個(gè)體復(fù)帛技術(shù)在常規(guī)育種或轉(zhuǎn)基因中加快豬染色體操作技術(shù)的應(yīng)用。本研究結(jié)果連同最近報(bào)道的豬胞質(zhì)內(nèi)精液注射技術(shù)都表明微注技術(shù)可推動豬克隆技術(shù)的發(fā)展。

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